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5 分钟学会 cas9 基因敲除

原问题:5 分钟学会 cas9 基因敲除——原本计划方案云云简朴

CRISPR/Cas9 体系作为细菌和古细菌的得到性免疫体系, 通过 RNA 介导特异性的切割外源遗传物质, 用以反抗入侵的病毒和质粒。操作 Cas9 来摧毁入侵 DNA 的 Type Ⅱ CRISPR/Cas 体系, 可以在体外举办基因的编辑。

为了进步CRISPR/Cas9 的特异性,行使 Cas9 切口酶和一对 sgRNA,两个临近的切口造成 DNA 双链断裂, 诱导细胞产生非同源结尾毗连修复, 造成目标基因的突变。

操作 CRISPR/Cas9 举办基因的编辑,起主要构建有用的 sgRNA。一样平常地,基因特异的 sgRNA 模板序列为位于 PAM 序列(Protospacer Adjacent Motif)前间区序列相近基序。这是一种见于 crRNA 分子的短核苷酸基序,可以被 Cas9 卵白特异性辨认并切割的 20 个 nt。 而 PAM 序列的特性为 NGG(个中 N 为恣意核苷酸)

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找敲除目标基因的外显子

按照目标基因选择待敲除靶基因位点找出敲除目标基因的外显子。 起首在第一个起始暗码子 ATG 之后的外显子中找出特异性高的上下流序列。以小鼠基因 Th 为例。在 pubmed 上找到基因的 mRNA 的 CDS 区,选择第二个外显子作为敲除位点。

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计划成对 sgRNA 序列

打开网站 ,亚盈国际,将基因名称,邮箱,第二外显子序列输入到对话框,点击 Agree and submit,守候网站计划成对的 sgRNA 序列。一样平常保举网站计划,由于网站可以猜测脱靶位点数,停止基因脱靶发生。虽然也可以手动选择特异的 sgRNA 序列。

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计划成对的 sgRNA 序列。打开 Nickase analysis,如图所示,网站会给出多构成对 sgRNA 序列,如箭头所示,而且猜测也许脱靶数。

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说明成对 sgRNA 序列

打开 ,将 sgRNA 输入,点击 Calcute,获得基因说明。综合思量 Tm(56~62)、GC content (45~60%) 及 secondary structure 来最终确定相宜的 sgRNA 序列,因此,高 score 的序列不必然是最佳序列。

如图,第一对 81 分的序列,Tm 值大于 62 度,并且存在不变二级布局,以是并不保举。以是应该从上述成对序列中继承探求吻合成对 sgRNA 序列。

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按照找到的吻合的 sgRNA 订购 oligo

图为 U6 真核表达载体计划,Forward oligo:5'-ACGG, Reverse oligo:5'-AAAC。

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关于 cas9 的几个留意事项

CRISPR-cas9 最首要的要求:PAM 序列为 NGG。

sgRNA,即 cas9 guide RNA,是引导 cas9 卵白在基因编辑位点举办定向切割,以是一样平常是 20 个碱基,不含 PAM 序列。

计划的 sgRNA 必然有用吗?一样平常计划好的 sgRNA 会在细胞程度验证下 DNA 程度的编辑服从,通过对细胞 DNA 序列测序以及 T7EN1 酶切验证敲减服从。对付目标基因,更首要的是验证卵白基因 mRNA 程度举办验证。

cas9 的相干应用:

(1)敲减细胞,可以选择 lenti-crisprv2 体系,通过包装慢病毒,可对目标细胞举办转染,并不绝药筛获得不变敲减细胞系。

(2)构建基因敲除编辑鼠。按照染色体修复方法又可分为 knockout 与 knockin 两种情势。

作者:不凡蓝色

图片来历:不凡蓝色